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外泌體是納米級(jí)的細(xì)胞外囊泡，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞間通訊。它們在納米醫(yī)學(xué)中具有巨大的應(yīng)用潛力。然而，其分離技術(shù)因?yàn)榘嘿F儀器和試劑受到限制。仿生納米技術(shù)為藥物、RNA干擾（RNAi）、蛋白質(zhì)遞送和無藥物療法提供*的支架，極大地影響了生物醫(yī)學(xué)。在大流行期間，納米技術(shù)在世界范圍內(nèi)mRNA疫苗和診斷試劑盒的開發(fā)中發(fā)揮了重要作用。然而，傳統(tǒng)納米材料在臨床的轉(zhuǎn)化因靶點(diǎn)識(shí)別能力差和成本高昂從而受到影響。在這方面，外泌體可能是解決上述問題的一個(gè)不錯(cuò)選擇。
外泌體是細(xì)胞外囊泡，大小范圍為30-200 nm，幾乎所有類型的細(xì)胞都會(huì)分泌。它們通過攜帶DNA、RNA、RNAi、蛋白質(zhì)、病毒、脂質(zhì)、小分子和可溶性因子等多種有效載荷參與細(xì)胞間通訊。這些物質(zhì)以旁分泌方式從親本（供體）輸送到受體細(xì)胞。外泌體繼承了有效載荷傳遞能力，這使它們成為藥物輸送的理想載體，通過將所需的物質(zhì)裝載在其內(nèi)部或表面。外泌體也可用作某些疾病的診斷標(biāo)志物，例如神經(jīng)退行性疾病和癌癥。外泌體還有穿越體內(nèi)所有生理屏障的能力，以及與血腦屏障（BBB）相關(guān)的能力，這在改善腦部疾病或切除腦癌方面存在重大意義。外泌體可以從所有體液中分離出來，包括血漿、尿液、腦脊液、羊水、胸腔積液、腹水、支氣管肺泡杠桿、細(xì)胞培養(yǎng)等，它們大量存在于所有體液中。基于外泌體的無細(xì)胞療法具有高濃度和易于進(jìn)入細(xì)胞和器官的特點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)中具有顯著的優(yōu)勢。
有幾種有效的外泌體分離方法，包括原型超速離心（用于80%的細(xì)胞外研究）、通過聚乙二醇（PEG）的密度梯度試劑、尺寸排阻色譜（SEC）和免疫沉淀等。然而，這些方法有一定的局限性，即超速離心機(jī)或商業(yè)試劑盒的成本高。此外，分離的外泌體樣品的純度、大小和濃度及其功能取決于所采用的分離方法。
凍干（真空冷凍干燥）現(xiàn)在通常用于延長富集外泌體的儲(chǔ)存時(shí)間。目前，它在外泌體分離中的應(yīng)用是比較新穎的。有趣的是，大多數(shù)外泌體儲(chǔ)存緩沖液都有一個(gè)維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。例如，4%海藻糖或10% w/v山梨糖醇和蔗糖有利于富集外泌體顆粒的冷凍干燥。同樣，理想的pH值為6.5-7.5，氨基酸、谷氨酸和1%FBS對外泌體的凍干過程是有利的，以避免冷凍休克并保持外泌體顆粒的結(jié)構(gòu)完整性。同樣，對于細(xì)胞培養(yǎng)基，Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基（DMEM）富含葡萄糖，pH值為6.8-7.4，主要富含L型谷氨酸，并補(bǔ)充10%FBS。與凍干的外泌體顆粒儲(chǔ)存培養(yǎng)基類似，也就是說細(xì)胞培養(yǎng)基可以保護(hù)外泌體。因此，基于凍干的技術(shù)能夠通過冷凍干燥老化的細(xì)胞培養(yǎng)基來分離外泌體。然而，我們?nèi)匀恍枰揽總鹘y(tǒng)的外泌體分離技術(shù)進(jìn)行洗滌。盡管SEC或超速離心可以在一定程度上達(dá)到這種效果，但沒有一種分離方法可以純化外泌體樣品免受蛋白質(zhì)污染。
外泌體分離技術(shù)的比較研究評(píng)估了用于外泌體純化的各種商業(yè)試劑盒的效率、純度和可重復(fù)性及其在血漿和血清樣品中的 miRNA 質(zhì)量。發(fā)現(xiàn)血清適合外泌體的分離，并且具有更多種類的外泌體 miRNA。研究還發(fā)現(xiàn)，每種分離方法在純度、外泌體數(shù)量和種類含量方面都存在一定的局限性。相比之下，血漿更有利于外泌體分離。對于所有類型的外泌體樣本，與商業(yè)試劑盒相比，即使是超速離心也受到產(chǎn)量較低的限制，但純度相對較高。研究表明，外泌體貨物的檢測和分離取決于所采用的分離程序?；趦龈赏饷隗w的分離方法因其簡單性和成本效益而是一種不錯(cuò)的選擇。
外泌體掃描電子顯微照片，比例尺：200 nm
使用凍干方法分離外泌體，并使用掃描電子顯微鏡 （SEM） 表征大小和形狀。此外，納米顆粒追蹤分析（NTA）用于準(zhǔn)確揭示樣品中外泌體的濃度和大小。貼壁細(xì)胞系和懸浮細(xì)胞系的細(xì)胞外囊泡平均大小均約為140 nm，這與報(bào)道的外泌體大?。?0-200 nm）相符?；诘鞍踪|(zhì)的外泌體的平均濃度可滿足下游應(yīng)用。一般外泌體表面的蛋白標(biāo)記物被認(rèn)為是其表征的標(biāo)準(zhǔn)。例如，CD9、CD63 和 CD81 是內(nèi)體特異性四跨膜蛋白。CD9首先在從樹突狀細(xì)胞中分離的外泌體上被發(fā)現(xiàn)。TSG101和HSP70是轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物所需的內(nèi)體分選復(fù)合物（ESCRT）復(fù)合物的組成部分，在外泌體生成中起著重要作用。鈣聯(lián)蛋白（Calnexin）是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志物，主要被評(píng)估為外泌體的陰性對照，主要存在于相對較大的囊泡上，而CD63存在于較小的囊泡上。Western blot試驗(yàn)證實(shí)，除鈣聯(lián)蛋白外，所有這些重要標(biāo)記物都存在于分離的外泌體表面。
外泌體在納米醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用有利于藥物遞送和診斷。研究人員通過用達(dá)沙替尼和普納替尼負(fù)載這些分離的外泌體來評(píng)估這些外泌體的藥物負(fù)載和釋放能力（達(dá)沙替尼和普納替尼被用作Ph+白血病的酪氨酸激酶抑制劑），觀察到外泌體可以有效地負(fù)載藥物并將藥物遞送至靶細(xì)胞。藥物釋放研究是通過在不同時(shí)間點(diǎn)收集樣本在體外進(jìn)行的。在8 h時(shí)，藥物釋放最佳，而在12 h時(shí)觀察到下降。研究結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)，因?yàn)镵562是一種白血病細(xì)胞系，具有較低的pH值，這會(huì)觸發(fā)藥物從外泌體釋放。
實(shí)驗(yàn)樣本：外泌體
實(shí)驗(yàn)?zāi)康模喝コ兴?，保持樣品美觀，方便保存及下一步試驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)設(shè)備：
真空冷凍干燥機(jī)Mercury180M
實(shí)驗(yàn)過程：
1、打開凍干機(jī)預(yù)冷，設(shè)置好凍干程序包括預(yù)凍和升華程序。
2、對樣品進(jìn)行前處理，加入合適的保護(hù)劑進(jìn)行預(yù)凍。如葡聚糖，甘露糖，海藻糖，復(fù)合保護(hù)劑。將樣品分裝到合適的容器內(nèi)，放置于凍干機(jī)隔板上，Mercury凍干機(jī)隔板均勻度達(dá)到了±1°C，可保證樣品的均一凍干狀態(tài)。
3、啟動(dòng)設(shè)置好的凍干程序，即預(yù)凍至-45℃，持續(xù)時(shí)間5h。升華程序-45℃～20℃，持續(xù)時(shí)間32h。此步驟可以利用凍干終點(diǎn)判斷功能，預(yù)估完成時(shí)間，可縮短反復(fù)查看的時(shí)間。
4、程序結(jié)束后，釋壓取出凍干好的樣品，觀察樣品狀態(tài)是否達(dá)到預(yù)期。如果達(dá)到隨即儲(chǔ)存或者進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：無保護(hù)劑組，外泌體直接凍干，凍干后比較松散。加入5%甘露醇后樣品更為美觀，且保存效果好。
凍干前后對比圖如下：
凍干前 VS 凍干后
左3為加入甘醇后樣品
